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    Cell Counting Kit簡稱CCK-8試劑盒,為MTT法的替代方法,是一種基於WST(水溶性四唑鹽,化學名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用於細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。CCK-8 細胞增殖.毒性檢測試劑盒

    Cell Counting KitCCK-8試劑盒)


    目錄號

    產品名稱

    規格

    包裝

    CC-K01

    Cell Counting Kit

    100

    1mL

    CC-K05

    Cell Counting Kit

    500

    5x1ml

    CC-K10

    Cell Counting Kit

    1000

    10x1mL

    CC-K30

    Cell Counting Kit

    3000

    30xmL


    產品簡介:

    Cell Counting Kit簡稱CCK 試劑盒,為MTT法的替代方法,是一種基於WST(水溶性四唑鹽,化學名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽)的廣泛應用於細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。


    CCK-8法與其它檢測方法之間的比較:

    細胞計數方法

    MTT

    XTT

    WST-1

    CCK-8

    形成的formazan的水溶性

    產品性狀

    粉末

    2瓶溶液

    溶液

    1瓶溶液

    使用方法

    配成溶液後使用

    現配現用

    無需預製

    無需預製

    檢測靈敏度

    很高

    很高

    檢測時間

    較長

    較短

    較短

    zui短

    檢測波長

    560-600nm

    420-480nm

    420-480nm

    430-490nm

    細胞毒性

    高,細胞形態完全消失

    很低,細胞形態不變

    很低,細胞形態不變

    很低,細胞形態不變

    試劑穩定性

    一般

    較差

    一般

    很好

    大批量樣品檢測

    可以

    非常適合

    非常適合

    非常適合

    便捷程度

    一般

    便捷

    便捷

    非常便捷









    CCK用途:藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗

     操作說明:

    一、製作標準曲線(測定細胞具體數量時)

    1、先用細胞計數板計數所製備的細胞懸液中的細胞數量,然後接種細胞。

    2、按比例(例如:1/2比例)依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度,一般要做3-5個細胞濃度梯度,每組3-6個複孔。

    3、接種後培養2-4小時使細胞貼壁,然後加CCK試劑培養一定時間後測定OD值,製作出一條以細胞數量為橫坐標(X軸),OD值為縱坐標(Y軸)的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量(試用此標準曲線的前提是實驗的條件要*,便於確定細胞的接種數量以及加入CCK後的培養時間。)

    二、細胞活性檢測

    1、在96孔板中接種細胞懸液(100μL/孔)。將培養板放在培養箱中預培養(在37,5% CO2的條件下)。

    2、向每孔加入10 μLCCK溶液(注意不要在孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數)。

    3、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

    4、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

    5、如果暫時不測定OD值,打算以後測定的話,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,並遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

    三、細胞增值-毒性檢測

    1、在96孔板中配置100μL的細胞懸液。將培養板在培養箱預培養24小時(在375% CO2的條件下)。

    2、向培養板加入10μL不同濃度的待測物質。

    3、將培養板在培養箱孵育一段適當的時間(例如:6122448小時)。

    4、想每孔加入10μL CCK溶液(注意不要再孔中生成氣泡,它們會影響OD值的讀數)。

    5、將培養板在培養箱內孵育1-4小時。

    6、用酶標儀測定在450nm處的吸光度。

    7、如果暫時不測定OD值,打算以後測定的話,可以向每孔中加入10 μL 0.1MHCL溶液或者1% w/v SDS溶液,並遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。

    注意:如果待測物質有氧化性或還原性的話,可在加CCK之前更換新鮮培養基(除去培養基,並用培養基洗滌細胞兩次,然後加入新的培養基),去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下,可以不更換培養基,直接扣除培養基中加入藥物後的空白吸收即可。
     備注:
    建議先做幾個孔摸索接種細胞的數量和加入CCK試劑後的培養時間。
    有條件的情況下建議采用多通道移液器,可以減少平行孔減的差異。加入CCK試劑時,建議斜貼著培養板壁加,不要插到培養基頁麵下加,容易產生氣泡,會幹擾OD值讀數。
    白細胞可能需要培養較長時間。
    當使用標準96孔板時,貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 / (100 μL 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低於2,500 / (100 μL 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,並按照每孔培養基總體積的10%加入CCK溶液。
    如果沒有450nm的濾光片,可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片,但是450nm濾光片的檢測靈敏度zui高。

    培養基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。

    活力計算:

    細胞活力*(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A0加藥)-A(空白)] ×100
    A(加藥):具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度
    A(空白):具有培養基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度
    A0加藥):具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
    *細胞活力:細胞增殖活力或細胞毒性活力

    1.一個孔中應接種多少個細胞當使用標準96孔板時,貼壁細胞的zui小接種量至少為1,000 / (100 μl 培養基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低,因此推薦接種量不低於2,500 / (100 μl 培養基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗,請先計算每孔相應的接種量,並按照每孔培養基總體積的10%加入CCK-8溶液。

    2.能否用384孔板進行試驗?

    可以。向各孔中加入培養基體積10%CCK-8溶液,如果加入的CCK-8體積太少,可以先將CCK-8溶液稀釋1倍,然後加入培養基體積20%的量。

    3.能否用24孔板進行試驗?

    可以。向各孔中加入培養基體積10%CCK-8溶液。

    4.酚紅會影響檢測嗎?

    不會。培養基中酚紅的吸光度可以在計算時,通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去,因此不會對檢測造成影響。

    5.CCK-8與胸苷結合檢測之間是否有相關性?

    有。然而,請注意由於CCK-8使用的檢測原理與胸苷檢測的不同,因此結果可能不同。

    6.CCK-8能否檢測細菌細胞?

    可以檢測E.coli,但不能檢測酵母細胞。向100 μl E.coli培養液中加入10 μl CCK-8溶液,隔夜或培養1-4個小時7.CCK-8穩定嗎?

    CCK-80-5下能夠保存至少6個月,在-20下避光可以保存1年。如果需要長期保存,91xj香蕉app推薦-20的儲藏條件。

    8.如果沒有450 nm的濾光片,還可以使用哪些其他濾光片?

    還可使用450 nm490 nm之間的濾光片。

    9.如何減少由於CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差?

    可以在加樣前用培養基稀釋CCK-8試劑並混勻後加樣。

    10.CCK-8是什麽顏色?

    應該是粉紅色。若顏色不一樣,有可能會影響測定。

    11.CCK8能否對活細胞進行染色?

    不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四唑鹽 (WST8),並通過電子載體1Methoxy PMS將活細胞中的電子交換到培養基中的WST8上。由於生成的甲ā也是高度水溶性的,因此CCK8不能對細胞進行染色。

    12.CCK8檢測溶液對細胞是否有毒?

    CCK8溶液自身因為高濃度的1Methoxy PMS的存在而具有一點毒性。但是,加到培養基中的CCK8是沒有毒性的,因為被稀釋了10倍。因此,長時間的培養,如隔夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK8檢測後還可以用於其他細胞增殖檢測,如結晶紫檢測,中性紅檢測或者DNA熒光檢測等。由於每種細胞對於CCK8的耐受力都不同,因此在需要進行長時間培養時,先檢測一下細胞在加入CCK8培養後的活力。

    13.在做加藥實驗時,藥物對測定是否有影響?如何解決?

    有時會有影響。如果藥物具有還原性,會和CCK8發生顯色反應,增加吸光度。解決辦法:首先要確認藥物是否有吸收,在含有藥物的培養基中加入CCK8,測定450 nm的吸光度,如果它的吸光度比不含藥物的培養基 (CCK8)的吸光度高,則證明藥物有影響,可在加CCK8之前更換培養基,去掉藥物的影響。

    14.每次測定的數值不一樣,是什麽原因?如何解決?

    可能會有以下幾個原因: 1. 當在培養箱內培養時,培養板zui外一圈的孔zui容易幹燥揮發,由於體積不準確而增加誤差。 一般情況下,zui外一圈的孔隻加培養基,不作為測定孔用。 2. 有可能會因為CCK8沾在壁上而產生誤差,建議在加入CCK8後,輕輕敲擊培養板以幫助混勻。 3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000100,000/孔範圍內摸索條件。

    15.如何設定空白對照?

    在不含細胞的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗(細胞毒性實驗)時,還應考慮藥物的吸收,可在不含細胞,加入藥物的培養基中加入CCK8,培養一定的時間,測定450 nm的吸光度作為空白對照。

    16.哪些物質會影響CCK8的測定?

    當有還原性物質存在時會影響CCK8的測定,例如含有維生素CGlucose (一般培養基中的量不多,酚紅或血清不影響測定)。在有酚紅存在的情況下,會增加空白吸收,但不影響測定,扣除空白吸收即可。

    17.在實驗中吸光度值太高,如果不能減少細胞數量,如何解決?

    可以縮短加入CCK8後的培養時間。例如:可以把加入CCK8試劑後的培養時間由2小時縮短為1小時。

    18.設定參比波長的目的是什麽?必須設定嗎?

    不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由於樣品混濁所帶來的吸收。

    19.說明書上僅寫了96孔板的測定方法,如果使用24孔板貨12孔板,應該加多少量CCK-8試劑?

    一般情況下建議加入CCK-8試劑的量是培養基體積的1/10

    20.CCK-8顯色過程中,如何終止反應?

    有一下幾種方法(96孔板): 1 在顯色反應後,將培養板仿佛4冰箱內。 2 每孔加10 μl 0.1 M HCL溶液。 3 每孔加10 μl 1%w/v)的SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液。注意:反應停止後,應在24小時之內測定。

    21.必須預培養細胞嗎?

    不一定。如果要向保持細胞的狀態,建議預培養細胞。如果不做細胞預培養,細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養,但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。

    22.如果加入的藥物中含有金屬,是否會有影響?

    金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度為1 Mm的氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑製5%15%90%的顯色反應,使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話,將會100%抑製。

    23.CCK-8試劑的保存條件?

    在避光條件下CCK-8試劑在4可保存一年。如果需要保存較長時間的話,推薦在-20下保存。但是CCK-8若反複解凍和冰凍將會增加空白吸收,從而影響檢測結果,若經常使用可將試劑存放在4冰箱內保存。

    24.預培養後,更換培養基需要細胞計數嗎?

    一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞,用血球計數盤計數,製備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話,可以預培養後取培養基用血球計數盤進行計數。

    25.CCK-8對於不同的細胞,靈敏度是否一樣?

    不一樣,懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對於貼壁細胞,一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高,但對於懸浮細胞則可能吸光度較低,可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。

    26.懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別?

    懸浮細胞由於染色比較困那,一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易,若細胞數量過大,有時吸光度會超過酶標儀的讀數。

    27.應該每次做標準曲線嗎?

    建議每次做。雖然細胞是一樣的,但是細胞的狀態不一定一樣,對於狀態不一樣的細胞,建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣,靈敏度可能會有輕微的差異,對於不同的批號建議分別做標準曲線。

    28.有時在藥物作用情況下,細胞已經死亡,但是脫氫酶的活性還在,是否能計算細胞數量?

    不能。由於CCK-8是通過和細胞內的脫氫酶進行反應間接反映活細胞數量,如果細胞已經死亡,但脫氫酶的活性還在,則試劑測定的細胞數量將會比真實值高,不能真實反映活細胞數量,建議采用別的方法測定。

    29.實驗之前,是否需要先檢測一下培養基和CCK-8是否會反應?

    建議使用一個孔作一下檢測,因為有培養基中可能含有氧化還原反應的物質,在正式實驗之前有必要先確認培養基和CCK-8是否反應。一般正常在的OD值應該在0.4以下。

    保存條件:

    4幹燥避光保存,有效期一年。

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